Kissan chaphamaparvoviruksen näkyvä ja nopea havaitseminen käyttämällä monientsyymiisotermistä nopeaa amplifikaatiota ja lateraalivirtausmittatikkumääritystä
Journal:Cellular- ja infektiomikrobiologian rajat
Vaikutustekijä:4.6
Kissan chaphamaparvovirus(FeChPV)on uusi parvovirus, joka havaittiin ensimmäisen kerran ripulista kärsivistä kissoista Kanadassa vuonna 2019. Sen patogeenisyys ja molekyyliominaisuudet ovat edelleen epäselviä, ja sillä on isäntä- ja geneettinen monimuotoisuus, mikä vaatii lisäepidemiologista tutkimusta. Tällä hetkellä ei ole standardoitua menetelmää FeChPV:n havaitsemiseen.
Monientsyymi isoterminen nopea amplifikaatio-lateral flow dipstick (MIRA-LFD) -menetelmäon käytetty menestyksekkäästi erilaisten virusten havaitsemiseen, mikä tarjoaa etuja, kuten nopeuden, yksinkertaisuuden ja tarkkuusinstrumenttien tarpeen. Tutkimusryhmä loi FeChPV:lle sopivan MIRA-LFD-menetelmän vastaamaan ruohonjuuritason kliinisen havaitsemisen haasteisiin. Luottamatta tarkkuusinstrumentteihin,MIRA-LFD-menetelmä suoritti FeChPV:n havaitsemisen 37 asteessa 20 minuutissa eikä osoittanut ristireaktiivisuutta muiden virusten kanssa. Havaintoraja oli 32,3 kopiota/μl,10 kertaa korkeampi kuin PCR-menetelmä. Lisäksi MIRA-LFD-menetelmä havaitsi 29 FeChPV-positiivista näytettä 417 ripulista kissasta, joiden positiivisuusaste oli hieman korkeampi kuin nested-PCR-menetelmällä. Nämä tulokset osoittavat, että vakiintunut MIRA-LFD-menetelmä FeChPV:n havaitsemiseen on tehokas, taloudellinen, luotettava ja yksinkertainen menetelmä, joka edistää FeChPV-infektion varhaista ehkäisyä ja valvontaa.
1.Kokeelliset menetelmät
Kliiniset näytteet:Tässä tutkimuksessa käytetyt peräsuolen pyyhkäisynäytteet otettiin 632 kissalta (joista 417 oli ripulia ja 115 tervettä kissaa) ja 474 koiralta (joista 342 oli ripuli ja 132 tervettä koiraa) eläinlääkäriklinikoilla Guangdongin, Henanin, Anhuin, Zhejiangin2 ja Mongolia the 0 Autonomousnerin2 provinssien2 ja Innomousnerin2 välillä. 2024.
Nukleiinihapon monistus:Uutettu DNA-nukleiinihappo lisättiin MIRA-järjestelmään. Rekombinaasi ja alukkeet muodostivat kompleksin; apuproteiinien ja yksijuosteisten proteiinien avulla ne tunkeutuivat kaksijuosteiseen DNA-templaattiin. Alukkeet sitoutuivat homologisiin komplementaarisiin alueisiin muodostaen D-silmukka-alueen, kun taas rekombinaasi hajoaa kompleksista. Polymeraasi sitoutui alukkeiden 3'-päähän ja aloitti DNA-synteesin monistaen eksponentiaalisesti templaatin kohdealuetta. Tämä prosessi eteni nopeasti ja tehokkaasti, mikä saavutti erittäin-kohdefragmentin monistumisen vain 15 minuutissa.
Testiliuskan värikehitys:Nukleiinihapon monistustuote laimennettiin 1:10, laitettiin testiliuskaan ja tulokset luettiin 5 minuutin kuluttua.
Koko prosessi nukleiinihapon monistamisesta testiliuskan värin kehittämiseen kesti vain 20 minuuttia.
Kokeessa käytettiin amp-tulevaisuuden biologisia tuotteita:
Tutkimuksessa seulottiin neljä suunniteltua sarjaa erityisiä aluke{0}}koetinyhdistelmiä. Tulosten esittämiseen käytettiin sekä agaroosigeelielektroforeesia että nukleiinihappotestiliuskoja. Kaikki neljä aluke-koetinyhdistelmää pystyivät havaitsemaan FeChPV-viruksen. Agaroosigeelielektroforeesitulosten mukaan FeChPV-4-yhdistelmä osoitti kirkkaimman kohdekaistan, joten tämä yhdistelmä valittiin myöhempään testaukseen.
Agaroosigeelielektroforeesitulosten mukaan 5, 10, 15 ja 20 minuutin monistus tuotti kaikki kohdevyöhykkeen. Tavoitenauhan intensiteetti saavutti huippunsa 15 minuutin amplifikaatiossa, mikä vahvisti 15 minuutin optimaalisen reaktioajan tälle määritykselle. Amplifikaatio 36 asteessa, 37 asteessa, 38 asteessa, 39 asteessa ja 40 asteessa tuotti kaikki kohdevyöhykkeen, kirkkain vyöhyke havaittiin 39 asteessa, mikä vahvisti 39 asteen optimaaliseksi reaktiolämpötilaksi tälle määritykselle.
(Kuva A: 1: vahvistus 5 minuuttia; 2: vahvistus 10 minuuttia; 3: vahvistus 15 minuuttia; 4: vahvistus 20 minuuttia) (kuva B: 1: vahvistus 36 astetta; 2: vahvistus 37 astetta; 3: vahvistus 38 astetta; 4: vahvistus 4 astetta; 3: 9 astetta;
2.Havaitsemissuorituskyky
Herkkyys:
(Kuva A: MIRA-tulokset on esitetty agaroosigeelielektroforeesilla)
(Kuva B: Sisäkkäiset PCR-tulokset esitetään agaroosigeelielektroforeesilla)
(Kuva C: MIRA-tulokset esitetty käyttäen nukleiinihappotestiliuskoja)
Näytteille suoritettiin 10-kertaiset sarjalaimennokset alkaen 3,23 x 106 kopiosta/μl. Sisäkkäinen PCR agaroosigeelielektroforeesilla pystyi havaitsemaan vakaasti 3,23 × 102 kopiota/μl; MIRA agaroosigeelielektroforeesilla ja MIRA nukleiinihappotestiliuskoilla pystyivät molemmat havaitsemaan stabiilisti 3,23 × 10¹ kopiota/μl.
MIRA-menetelmä osoitti johdonmukaista herkkyyttä käyttämällä kahta eri tulosten esitysmuotoa, ja MIRA-menetelmän herkkyys oli parempi kuin sisäkkäisen PCR:n.
Spesifisyys:
(1: FeChPV, kissan chaphamaparvovirus; 2: FPV, kissan panleukopeniavirus; 3: FeAstV, kissan astrovirus; 4: FBoV, kissan bocavirus; 5: CachaV, koiran chaparvovirus; 6: negatiivinen kontrolli)
Äskettäin perustettu MIRA-LFD-menetelmä havaitsi vain FeChPV:n eikä osoittanut ristireaktiivisuutta muiden vertailuvirusten kanssa, mikä osoittaa hyvää spesifisyyttä.
3. Tutkimuksen yhteenveto
Tämä tutkimus loi MIRA{0}}LFD-menetelmän FeChPV:n havaitsemiseen ilman, että{1}}tarkkuuslaitteita tarvitaan. Tehokas, taloudellinen ja luotettava havaitsemismenetelmä, jolla on korkea herkkyys ja spesifisyys, MIRA-LFD-menetelmä soveltuu paremmin kliiniseen havaitsemiseen ja tarjoaa teknistä tukea FeChPV-infektion varhaiseen ehkäisyyn ja valvontaan.
4.AMP-TULEVIA BIOTEKNIIKKAA
MIRA-monientsyymi isoterminen nopea nukleiinihapon monistus on tekniikka, joka todella mahdollistaa nopean havaitsemisen paikan päällä.
MIRA-teknologia perustuu in vivo -geenin rekombinaatiokorjausmekanismiin, joka perustuu useiden funktionaalisten proteiinien synergistiseen vaikutukseen huoneenlämpötilassa nopean (5-20 min), herkän, spesifisen ja turvallisen nukleiinihapon monistumisen saavuttamiseksi huoneenlämpötilassa (25–45 astetta). MIRA-tekniikan isotermisen luonteen vuoksi sillä on alhaiset laitteistovaatimukset ja yksinkertainen käyttö. Pienikokoisten kannettavien laitteiden ansiosta sitä voidaan soveltaa etulinjan testaukseen erilaisissa sovellusskenaarioissa, mikä tuo nopean ja tarkan nukleiinihappotestauksen sellaisiin kohteisiin kuin POCT, kotitestaus, maatalouspellot ja{7}}paikan päällä tapahtuva lainvalvonta. MIRA-teknologiaan perustuen Amp-future Biotech on kehittänyt joukon paikan päällä-pikatestaustuotteita, mukaan lukien nopeasti nukleiinihappoja vapauttavat aineet, isotermiset nopeasti nukleiinihappojen monistusreagenssit, kolloidiset kultatestiliuskat ja miniatyyrisoidut kannettavat laitteet, jotka luovat kokonaisratkaisun paikan päällä tapahtuvaan{11}pikamolekyylitestaukseen. Lisäksi Amp-futuren MIRA-teknologia tarjoaa sovellusetuja yhdistettynä CRISPR-teknologiaan, NGS:ään, SNP:hen, mikrofluidiikkaan ja muihin.
Yllä näytetyn -paikan päällä testattavan pikatestauksen tuotteiden lisäksi Amp-future Biotech tarjoaa myös:
Tutkimusreagenssit:Reagenssiraaka-aineiden ja teknisen tuen tarjoaminen tieteelliseen perustutkimukseen sekä projektikirjallisuuden lähteet.
OEM-tuotanto:Pystyy itsenäisesti tuottamaan erittäin{0}}puhtaita, korkea-aktiivisia{1}}valmiita tuotteita koko prosessin ajan, mikä saavuttaa teollisen-mittakaavan tuotannon.
Projektin tilauskehitys:Sekvenssitiedot ja sekvenssin kohdistusanalyysin tulokset, projektin aluke{0}}koettimen suunnittelu ja synteesi, projektiplasmidisynteesi ja -näytteet, projektiraportit ja tulokset jne.
Lisätietoja, tervetuloa tiedustelemaan.