Molekyylidiagnostiikan alalla polymeraasiketjureaktiota (PCR) on pitkään pidetty kultaisena standardina nukleiinihappojen havaitsemisessa. Viime vuosina isotermiset vahvistustekniikat, joita edustaa rekombinaasipolymeraasiamplifikaatio (RPA), ovat saaneet yhä enemmän huomiota nopeudensa, yksinkertaisuutensa ja paikan päällä tehtävään testaukseen soveltuvuutensa vuoksi.
Vaikka sekä PCR että RPA ovat nukleiinihapon monistusmenetelmiä, ne eroavat toisistaan merkittävästi toimintaperiaatteiltaan, laitevaatimuksiltaan ja sovellusskenaarioiltaan, mikä tekee jokaisesta tekniikasta sopivan erilaisiin diagnostisiin tarpeisiin.
1. Perusperiaatteet: lämpöpyöräily vs. vakio-lämpötilan vahvistus
PCR on biokemiallinen prosessi, joka pystyy monistamaan yhden DNA-molekyylin miljooniksi kopioiksi lyhyessä ajassa. Reaktio perustuu toistuvaan lämpökiertoon ja koostuu kolmesta päävaiheesta:
1.Denaturaatio (90–95 astetta) – Kaksijuosteinen DNA erotetaan yksittäisiksi juosteiksi.
2. Hehkutus (55–65 astetta) – Alukkeet sitoutuvat kohdesekvensseihin.
3. Extension (72 astetta) – DNA-polymeraasi syntetisoi uusia DNA-säikeitä.
Näiden lämpötila{0}}säädeltyjen syklien kautta kohde-DNA monistuu eksponentiaalisesti erittäin tarkasti. PCR vaatii kuitenkin monimutkaisia lämpökiertolaitteita ja kestää yleensä 1–2 tuntia.
Sitä vastoin RPA toimii vakiolämpötilassa 37–42 astetta, mikä mahdollistaa nopean nukleiinihapon monistumisen ilman lämpökiertoa. Tekniikka perustuu rekombinaasiproteiinien, yksijuosteisten DNA-sitovien proteiinien ja juosteen-syrjäyttävän DNA-polymeraasin koordinoituun toimintaan erittäin spesifisen kohteen monistumisen saavuttamiseksi isotermisissa olosuhteissa.
RPA:ssa käytetyllä DNA-polymeraasilla on juosteen syrjäytysaktiivisuutta, mutta siitä puuttuu 5'→3'-eksonukleaasiaktiivisuus. Monistuksen aikana ulommat alukkeet ulottuvat templaattinauhaa pitkin. Kun he kohtaavat kaksijuosteisia alueita, jotka on syntetisoitu sisäisistä alukkeista, polymeraasi ei voi hajottaa alavirran juosta, vaan syrjäyttää sen luoden uusia monistustuotteita.
Koko reaktio suoritetaan loppuun vakiolämpötilassa, mikä poistaa monimutkaisen instrumentoinnin tarpeen ja mahdollistaa todellisen-huollon-pisteen ja kenttä{2}}pohjaisen testauksen. Käänteiskopioijaentsyymin sisällyttämisellä RPA:ta voidaan soveltaa myös RNA-kohteen havaitsemiseen.
Monistustuloksia voidaan analysoida käyttämällä useita lukumuotoja, mukaan lukien päätepisteiden havaitseminen, reaaliaikainen fluoresenssin seuranta, sivuvirtausmääritykset, ja ne voidaan integroida edelleen CRISPR-Cas-järjestelmiin, mikrofluidiikkajärjestelmiin tai seuraavan -sukupolven sekvensointiin (NGS) kehittynyttä määritystä varten.
Sovellusskenaariot: laboratoriotarkkuus vs. paikan päällä tapahtuva nopea testaus-
PCR:stä on tullut yksi arvokkaimmista molekyylidiagnostiikan tekniikoista, ja se on edelleen nukleiinihappotestauksen kultastandardi.
Korkean tarkkuutensa, kustannustehokkuutensa ja
Toisaalta RPA tarjoaa selkeitä etuja nopeassa{0}}paikan päällä tapahtuvassa diagnostiikassa. Vahvistus valmistuu vain 20 minuutissa, minimaaliset laitteistovaatimukset ja yksinkertainen käyttö, joten RPA sopii ihanteellisesti.
- Perusterveydenhuolto ja ensiapuasetukset
- Tulli- ja rajatarkastus
- Eläin- ja kasvitautien kenttäseulonta
- Ympäristö- ja elintarviketurvallisuustestaus
Yhdistettynä kannettavien laitteiden ja lateraalivirtausliuskojen kanssa RPA mahdollistaa nopean ja luotettavan molekyylitestauksen perinteisten laboratorioiden ulkopuolella.
MIRA (Multienzyme Isothermal Rapid Amplification)on Amp Futuren patentoitu isoterminen vahvistustekniikka. Se kuuluu samaan tekniseen perheeseen kuin RPA, ja se on saanut inspiraationsa luonnollisista DNA:n rekombinaatio- ja korjausmekanismeista, jotka hyödyntävät useita toiminnallisia entsyymejä nopean nukleiinihapon monistumisen saavuttamiseksi vakiolämpötilassa.
MIRA käyttää koordinoitua järjestelmää viidestä keskeisestä entsyymistä, mukaan lukien helikaasi, rekombinaasi, yksijuosteinen DNA-sitova proteiini ja DNA-polymeraasi, mikä mahdollistaa:
- Laaja käyttölämpötila-alue: 25-45 astetta
- Nopea vahvistus: tulokset 20 minuutissa
- Korkea herkkyys ja spesifisyys
- Parempi turvallisuus ja pienempi kontaminaatioriski
MIRA on nukleiinihappojen monistustekniikka, joka on suunniteltu erityisesti paikan päällä ja hoitopisteessä-tehtäviin-testeihin.
MIRA-alustan pohjalta Amp Future on kehittänyt kattavan tuotevalikoiman nopeaan molekyylipainotteiseen POCT:hen, mukaan lukien:
Nopeasti nukleiinihappoa vapauttava aine:
Monistettava nukleiinihappo saadaan 5 minuutissa huoneenlämpötilassa; alhainen esto mahdollistaa täyden näytteen lataamisen jopa 50 μl asti; huonelämpötilassa kuljetus ja varastointi, valosuojaa ei tarvita.
Isoterminen nukleiinihapon monistusreagenssi:
Vahvistus valmistui 5-20 minuutissa, nopea ja tehokas; erilaiset reagenssimuodot (lyofilisoitu jauhe, lyofilisoidut mikropallot jne.); erilaisia tulosten esitysmenetelmiä (elektroforeesi, fluoresenssi, testiliuskat).
Pienoistetut kannettavat laitteet:
Digitaaliset isotermiset ilmaisimet, taskukokoiset -testaustyökalut, jotka on helppo pitää yhdessä kädessä, varustettu virtapankilla, vapauttavat sinut laboratorion rajoituksista ja tuovat tarkan nukleiinihappotestauksen kentälle.
Yksi/useita testiliuskoja:
Optimoitu MIRA-metodologian perusteella paremman yhteensopivuuden saavuttamiseksi; yhdistettynä MIRA-teknologiaan, mikä korostaa käyttömukavuutta.
Täysin automatisoitu nukleiinihapon monistusanalysaattori:
Vaatii vain yhden näytteen lataustoiminnon täysin automaattista havaitsemista varten; tunnistusraja yhteen kopioon asti; isoterminen vahvistus ja automaattinen rajoitus vähentävät kontaminaatioriskiä.
Sivuston pikatestauspaketti:-
Testaus paikan päällä, milloin tahansa, missä tahansa, kaikki yhdessä paketissa; suorittaa testin 30 minuutissa, tarkka ja herkkä.
Jos haluat lisätietoja tuotteista tai ratkaisuista, ota rohkeasti yhteyttä.