Cas12-aktiivisuuden säädettävä hallinta edistää yleistä ja nopeaa yhden-potin nukleiinihapon havaitsemista
Julkaisija: University of Science and Technology of China
Lehti: Nature Communications
Vaikutuskerroin: 14.7
MIRA-teknologian avulla kehitettiin natriumhepariiniin perustuva universaali one{0}}pot fluorescent nukleiinihappojen havaitsemismenetelmä (SURVEY). Tutkimukset ovat osoittaneet, että natriumhepariini voi säädellä Cas12a:n pilkkoutumisaktiivisuutta häiritsemällä Cas12a-crRNA-sitoutumisprosessia. Säätämällä natriumhepariinin pitoisuutta SURVEY on yhteensopiva sekä klassisten että suboptimaalisten PAM-sekvenssien kanssa ja soveltuu useisiin Cas12-alatyyppeihin. Tällä menetelmällä, jonka havaitsemisaika on vain 15-20 minuuttia, herkkyys ja spesifisyys ylittää 95 % apinapox-pseudoviruksen, influenssa A -viruksen ja SARS-CoV-2:n havaitsemiseksi. Se on edullinen-, ja se tarjoaa uuden, hoitopisteen havaitsemismenetelmän lääketieteelliseen kenttädiagnostiikkaan ja ympäristön seurantaan. Se ratkaisee perinteisen CRISPR-diagnostiikan herkkyyden ja spesifisyyden vaikean tasapainon.
1. Hepariininatriumin vaikutusmekanismin tutkimus
Fluoresoiva koetin lisättiin Cas12a-crRNA-järjestelmään, joka sisälsi 10 nM kohde-DNA:ta, ja nopea ja merkittävä fluoresoiva signaali havaittiin lisäämättä natriumhepariinia. Kun 0,2 ug/ml natriumhepariinia lisättiin, fluoresoiva signaali oli samanlainen kuin kontrolliryhmän signaali, mikä osoittaa, että natriumhepariini esti suuresti Cas12a:n trans-katkaisuaktiivisuutta. 0.2 ug/ml natriumhepariinia on pienin estävä pitoisuus. Kun natriumhepariinin pitoisuus nousee arvosta 0,2 ug/ml arvoon 0,5 ug/ml, Cas12a:n cis-katkaisuaktiivisuus estyy vähitellen, ja pitoisuudella 0,5 ug/ml trans-katkaisuaktiivisuus estyy lähes kokonaan. Natriumhepariinin vaikutusmekanismia koskevat tutkimukset ovat osoittaneet, että natriumhepariinin negatiivisesti varautuneet ryhmät häiritsevät crRNA:n oikeaa sitoutumista Cas12a:han ja voivat vaikuttaa crRNACas12a-binaarisen kompleksin muodostumiseen.
- MIRA-Cas12a yhden-potin tunnistus
Natriumhepariinin vaikutusmekanismin vahvistamisen jälkeen artikkelissa tutkittiin yhden -potin havaitsemisstrategiaa (MIRA-Cas12a), jossa yhdistettiin MIRA-vahvistus ja Cas12a{4}}-välitteinen fluoresenssin havaitseminen yhdessä putkessa.
Natriumhepariinin puuttuessa MIRA-Cas12a-yhdistelmä ei tuottanut merkittävää fluoresenssisignaalia kohdegeenin konsentraatioalueella 0,1-10 fM. Natriumhepariinin pitoisuudella 40 µg/ml havaittiin merkittävä fluoresenssisignaali tavoitekonsentraatioalueella 1 aM (≈0,6 kopiota/μL, tilavuus=30 μL) - 10 fM (≈6 000 kopiota/μl, tilavuus=30} µl:n parannus, 0:sta havaitsemisesta yli 0 µl). järjestelmä ilman natriumhepariinia.
Apinarokkoviruksen templaattikonsentraatio oli 10 fM, ja Cas12a-crRNA:ta (100 nM) käytettiin kohdegeenien f31 ja b6r havaitsemiseen. Monistusreaktio lopetettiin 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 ja 20 minuutin kohdalla, ja MIRA-monistustuotteen pitoisuus eri aikoina analysoitiin agaroosigeeleillä. Tuloksena saadut tuotteet analysoitiin agaroosigeeleillä kolmella eri asetuksella: MIRA-hepariininatrium ilman Cas12a:ta, MIRA-Cas12a ilman hepariininatriumia ja MIRA-Cas12a hepariininatriumin kanssa. Tulokset osoittivat, että hepariininatriumin puuttuessa nukleiinihappojen monistuminen estyi Cas12a:n korkean cis-katkaisuaktiivisuuden vuoksi. Hepariininatriumin lisääminen lisäsi kuitenkin merkittävästi nukleiinihappojen monistumista, koska Cas12a:n cis-katkaisuaktiivisuus väheni.
Artikkeli osoittaa, että natriumhepariiniin perustuva universaali one{0}}pot fluorescent nukleiinihappojen havaitsemismenetelmä (SURVEY) voidaan saavuttaa käyttämällä sekä klassisia PAM- että suboptimaalisia PAM-sekvenssejä. Lisäksi CRISPR-Dx-menetelmissä käytetään laajasti LbCas12a:n lisäksi AsCas12a:ta ja AapCas12b:tä. MIRA-AsCas12a:ta käyttävässä järjestelmässä fluoresenssi havaittiin vain 40 ug/ml natriumhepariinin läsnä ollessa, mikä osoittaa, että se pystyy havaitsemaan 1 fM f31- ja b6r-geenejä. Natriumhepariinin puuttuessa MIRA-AapCas12b voi havaita yhden f31- ja b6r-geenin. 20 ug/ml natriumhepariinin antaminen ei vain kiihdyttänyt MIRA-AapCas12b:n havaitsemisnopeutta, vaan myös lisäsi fluoresenssin intensiteettiä. Nämä havainnot osoittavat, että natriumhepariinin annostelulla kehitetty yhden -astian menetelmä soveltuu myös muihin Cas12-alatyyppeihin.
